Document
Enhanced heavy oil recovery through biotransformation by spore-forming bacteria isolated from contaminated soil samples
Publisher
Sultan Qaboos University
Gregorian
2017
Language
English
English abstract
Diminishing light oil resources and minimal change in energy consumption has led explorers to develop the low quality heavy crude oil (HCO) resources that are estimated at seven times that of conventional crude oils through numerous means of enhanced oil recovery (EOR) methods. Microbial EOR (MEOR) methods depend on bacteria and bacterial bioproducts to extract remaining oil volumes at petroleum reservoirs and they are environmentally friendly. In this context, the study aimed to isolate and characterize local microbes that can degrade heavy crude oil and evaluate the effectiveness of the biotransformation process. The study was conducted on bacteria isolated from oil-contaminated soil samples collected from oil sludge pits and heavy crude oil of an Omani oil field.
DNA from the soil samples was extracted from the V3-V4 region of 16S rRNA and sequenced using Illumina MiSeq sequencer in order to perform the biodiversity analyses. Firmicutes and Proteobacteria were the most abundant phyla at the samples. At genus level, Halanaerobium dominated across all the samples followed by Deferribacter and Desulfovermiculus. As expected at such case of HCO contaminated that naturally contains sulfur, sulfate-reducing bacteria (SRB) were abundant. The findings supported the use of contaminated soil with heavy crude oil as a source for bacteria that are able to survive harsh conditions and degrade crude oil for bioremediation and enhanced oil recovery purposes.
Collected soil samples were heated to narrow the bacterial pool and focus the research on spore forming bacteria only. Bacteria were grown in five different minimal salts media and were isolated from the soils samples and the HCO sample. The isolates were identified by MALDI biotyper and 16S rRNA sequencing. The nucleotide sequences were registered in GenBank (NCBI) database (accession numbers: KJ729814 to KJ729828). Microbial growth and HCO biodegradation were assessed by growth at flasks, well-assays on agar plates and GC-FID of extracted crude oil. Among the five selected minimal salts media, the M2 medium was the best medium for growth and biotransformation. Among the isolates, B. licheniformis AS5 and B. subtilis AS2 were the most efficient isolate in biotransformation. Biotransformation of HCO by AS1 to AS10 isolates was evaluated by GC-FID according to mixed n-alkane gas chromatography standard after 30 days of incubation. More than 50% of C24 was degraded and C16, C18 and C26 were degraded by most isolates. A significant increase of C12 and C14 by several isolates indicated HCO biotransformation from heavier to lighter compounds.
The key challenge of experimental in-situ anaerobic biotransformation of HCO is time as a single in-situ flooding experiment could take at least three weeks including incubation of bacteria at the cores. Thus, sand pack column flooding experiments were conducted in order to save time and cost. Regrettably, the sand pack columns did not work effectively due to brine bypassing oil.
Effects of different nitrogen sources, glucose and sodium thiosulfate on growth and biotransformation were investigated. Yeast extract was the most favorable nitrogen source for our bacteria as it resulted in the highest growth level in comparison to urea and ammonium nitrate nitrogen sources. Glucose addition to M2 medium led to increased bacterial growth at aerobic and anaerobic conditions while sodium thiosulfate resulted in reduced growth.
In core flooding experiments, AS5 showed promising results by increasing HCO recovery factor (RF) by 16% after 5 days of incubation. In subsequent flooding experiments, biotransformation RF dropped to 3% due to slowed bacterial growth. By increasing incubation time and inoculation percentages, RF increased to 5%. The addition of 2%m/v (2 g/100 ml) glucose into M2 medium increased RF to 16.4% after 2 weeks of incubation and to 18.3% after 6 weeks of incubation.
Whole genome sequencing analysis and annotation were conducted on AS2 and A$5 and were compared to type strains B. subtilis str. 168 and B. licheniformis DSM 13. On biodegradation, aromatic compounds degradation gene: pcaC and aminobenzoate degradation gene: atoD were found at AS2 but not at type strain B. subtilis str. 168. A$5 and type strain B. licheniformis DSM 13 had similar degradation genes except these of the styrene where AS5 had E3.5.1.4/amiE and catE genes while B. licheniformis DSM 13 had feaB and catE genes. AS2, A$5 and type strains contained many similar degradation genes of 13 other hydrocarbon compounds involving various genes. On biosurfactants, AS2 had surfactin and iturin biosurfactants family genes while B. subtilis str. 168 had surfactin and plipastatin biosurfactants family genes. AS5 and B. licheniformis DSM 13 had similar lichenysin genes. On biopolymers, AS2 and AS5 had the race, ywtB, ywtD and ggt genes; however, did not contain the polygamma-glutamate biosynthesis protein pgsC observed at the type strains.
Bacteria of this study did not produce any bioproducts. Thus, other media were tested which were used in literature to produce metabolites from bacteria similar to this study's isolated bacteria. At the experiments, biosurfactant was produced by AS2 while A$5 did not produce neither biosurfactant nor biopolymer. The lowest observed surface tension was 28.8+0.8 mN/m at MP8 by AS2, AS2 MP8 interfacial tension to hexadecane was 4.240.6 mN/m. The performance of the AS2 biosurfactant was comparable to biosurfactants similar to its kind. The IR spectrum showed similarity to the standard surfactin biosurfactant. The sand pack flooding results showed 4-5% additional recovery. This is a good indication that the biosurfactant could work at core flooding experiments.
Member of
Resource URL
Arabic abstract
ان تناقص موارد النفط الخفيف السهل الإنتاج واستقرار مستوى استهلاك الطاقة كما هو عليه، دفعت مستكشفي ومنتجي النفط لتطوير موارد النفط الخام الثقيلة المنخفضة الجودة الصعبة الإنتاج التي تقدر مواردها بسبعة اضعاف تلك التقليدية من النفط الخفيف من خلال تقنيات الاستخلاص المعزز للنفط (EOR). لكل تقنية من هذه التقنيات ومن ضمنها الميكروبية، مزاياها وحدود معينة للتطبيق. بخلاف تقنيات الاستخلاص المعزز للنفط الأخرى، تتميز تقنيات الاستخلاص المعزز الميكروبي للنفط (MEOR) بحاجتها القليلة للطاقة الإنتاج البكتيريا الكائنات الحية الدقيقة أو المنتجات الحيوية البكتيرية وانتاجها لا يعتمد مباشرة بشكل رئيسي على أسعار النفط الخام. وبالإضافة إلى ذلك، هذه التقنيات صديقة للبيئة. بالتالي، سعت الدراسة إلى العثور على میكروبات محلية يمكنها أن تتحلل النفط الخام الثقيل الى مكونات اقل كثافة وتقييم فعالية عملية التحول الأحيائي. في بحثي هذا، تم الحصول البكتيريا من النفط الثقيل الخام لحقل قرن علم ومن عينات التربة الملوثة بالنفط الخام التثقيل التي يتع جمعها من عمليات الحفر المستمرة بالحقل.
أشار تحليل التنوع البيولوجي (metagenomics) باستخدام Illumina Miseq sequencer لعينات التربية الى وفرة شعبتي (phyla) البكتيريا Firmicutes و Proteobacteria المحتويتان على العديد من انواع البكتيريا المحللة للنفط تراوحت نسبة وفرة Firinnicutes من 24% إلى 36 % و Proteobacteria من % 27 إلى 55%. على مستوى نوع البكتيريا ( Halanaerobium ( genus كانت الأكثر وفرة في جميع العينات وتلتها Deferribacter و Desulfovermiculus وكما هو متوقع في حالة تلوث التربة بالنفط الخام التقيل المحتوي للكبريت، بكتيريا معالجة الكبريتات (sulfate - reducing bacteria) كانت وفيرة. دعمت النتائج استخدام التربة الملوئة بالنفط الخام الثقيل كمصدر للبكتيريا التي يمكنها البقاء في الظروف القاسية واغراض الاستخلاص المعزز الميكروبي للنفطي.
هنالك العديد من البكتيريا التي يمكنها النمو باستخدام النفط الخام الخفيف كمصدر لعنصر الكربون ولكن البكتيريا يمكنها التي النمو باستخدام النفط الخام الثقيل فقط محدودة. استهدف البحث العثور على Spore -forning bacteria وبالتالي تم تسخين عينات التربة للتخلص من جميع أنواع البكتيريا التي لا يمكنها تحمل الحرارة ولا يمكنها تكوين ابواغ (spores) بداخلها. تم اختبار خمسة أنواع من السوائل المغذية للبكتيريا بإضافة النفط الثقيل الخام (API 13°) كمصدر وحيد للكربون وتم العثور على 15 سلالة من بكتيريا Bacillus subtilis و Bacillus licheniformis. تم تحديد سلالة البكتيريا عن طريق MALDI biotyper و 16S rRNA sequencing وجل تسلسل ال 16S rRNA في قاعدة بيانات بنك الجينات ( GenBank NCBI accession numbers: KJ729814 to KJ729828)
اثبتت البكتيريا قدرتها على تحليل النفط الخام الثقيل في الظروف الهوائية واللاهوائية من خلال photospectrometer و well - assays و GC - FID وثبت أن أفضل وسيط للنمو هو السائل المغذي M2. كانت بكتيريا Bacillus subtilis AS2 و Bacillus licheniformis AS5 الأكثر كفاءة في التحلل الأحيائي للنفط في اختبارات ضخ السوائل بعينات الصخور الرملية (Berea Sandstone) المحاكيه للظروف الميدانية بحقول النفط، زادت بكتيريا Bacillus licheniformis AS5 نسبة استخلاص النفط الخام الثقيل 16% بعد أبقائها بالصخور الرملية. أظهرت الدراسة المجهرية المقطعية للصخور نمو البكتيريا بداخلها وأظهر تحليل GC-FJD تحلل النفط المنتج. يتمثل التحدي الرئيسي من التجربة اللاهوائية لضخ السوائل والنفط الخام الثقيل والبكتيريا بعينات الصخور الرملية في الوقت حيث ان تجربة عينة الصخر الواحدة تستغرق ما لا يقل عن ثلاثة أسابيع بما في ذلك فترة حضانة البكتيريا. وبالتالي تم اختبار تجربة ضخ أعمدة الرمال كبديل لضخ عينات الصخور الرملية بهدف توفير الوقت والكلفة. ولكن وعلى الرغم من قابلية كونها الحل الأنسب لمثل هذه التجارب الطويلة الأمد في الصخور، فإن تجربة ضخ أعمدة الرمال لم تنجح بسبب المسامية والنفاذية العاليتين لأعمدة الرمال ولزوجة النفط الثقيل معا.
أظهرت اختبارات فعالية استبدال مصادر النيتروجين المختلفة بالسائل المغذي M2 آن خلاصة الخميرة ( yeast extract) هي مصدر النيتروجين الأمثل للبكتيريا حيث أظهرت أعلى مستوى النمو بالمقارنة مع اليوريا (urea) ونترات الأمونيوم (ammonium nitrate). واسفرت الاختبارات آن اضافة الجلوكوز (glucose) أدت الى زيادة نمو البكتيريا وبالمقابل أدت اضافة ثيوكبريتات الصوديوم (sodium thiosulfate) الى انخفاض النمو.
تمت سلسلة الجينوم كاملا لكل من بكتيريا Bacillus subtilis AS2 و Bacillus licheniformis AS5 ومقارنتها بانواعها من البكتيريا النموذجية 168 .Bacillus subtilis str و Bacillus lichenifornis DSM
13. بالنسبة الى الخصائص المتعلقة بقدرة البكتيريا على تحليل المركبات، تميزت بكتيريا AS2 بإثنان من الجينات لم تظهرهما البكتيريا النموذجية 168 .Bacillus subtilis str: جين تحلل المركبات العطرية ( aromatic
pcaC ( compounds و جین تحلل مركبات الأمينوبنزوات (atoD ( aminobenzoate واحتوت بكتيريا AS5 على جينات تحلل مركبات مماثلة للبكتيريا النموذجية 13 Bacillus licheniformis DSM في ما عدا تلك المتعلقة بتحلل مركب Styrene. تساوت جميع البكتيريا المحلية والنموذجية في احتوائها لجينات تحلل مماثلة الثلاثة عشر نوعا من المركبات الهيدروكربونية الأخرى وتضمنت على مختلف الجينات، ولم تحتوي اي منهما على جينات تحلل المركبات التالية: Fluorobenzoate و Toluene و Nitrotoluene و polycyclic aromatic hydrocarbon. بالنسبة الى الخصائص المتعلقة بقدرة البكتيريا على انتاج biosurfactants، احتوت بكتيريا AS2 على جينات surfactin and iturin biosurfactants في حين احتوت البكتيريا النموذجية Bacillus 168 .subtilis str على جينات surfactin and plipastatin biosurfactants، واحتوت بكتيريا AS5 على جيناتlichenysin biosurfactant مماثلة للبكتيريا النموذجية 13 Bacillus licheniformis DSM.
لم تنتج البكتيريا أي منتجات بكتيرية (bioproducts) باستخدام السوائل المغذية السابقة. وبالتالي تم اختبار اثنان من السوائل المغذية المستخدمة لإنتاج منتجات بكتيرية من بكتيريا مشابهة لبكتيريا هذه الدراسة. انتجت بكتيريا AS2 مركب منشط للسطح (biosurfactant) ولم تنتج بكتيريا AS5 أي منتج. تمكنت بكتيريا AS2 من خفض التوتر السطحي (surface tension) مع الهواء إلى /xmN 28 . 78 + 0 .) الى mN/ m 4 . 22 + 0 . 60 . اشارت اختبارات أعمدة الرمال الأولية إلى إمكانية زيادة نسبة استخلاص النفط الخام الثقيل بنسبة %5 -4 عن طريق ضخ AS2 biosurfactant مما يعد مؤشرا جيدا لإمكانية زيادة نسبة استخلاص النفط بعينات الصخورالرملية المحاكيه للظروف الميدانية. أظهر طيف الأشعة تحت الحمراء FTIR تشابه AS2 biosurfactant مع مركب منشط السطح القياسي Surfactin (biosurfactant ( Sigina chemicals , USA . أما بالنسبة الى الخصائص المتعلقة بقدرة البكتيريا على إنتاج البوليمر، أظهرت كل من البكتيريا المحلية والنموذجية جينات مماثلة لإنتاج وتحلل البوليمر الحيوي ولكن لم توجد بالبكتيريا المحلية AS2 و AS5 جين انتاج البوليمر: pesC.
أشار تحليل التنوع البيولوجي (metagenomics) باستخدام Illumina Miseq sequencer لعينات التربية الى وفرة شعبتي (phyla) البكتيريا Firmicutes و Proteobacteria المحتويتان على العديد من انواع البكتيريا المحللة للنفط تراوحت نسبة وفرة Firinnicutes من 24% إلى 36 % و Proteobacteria من % 27 إلى 55%. على مستوى نوع البكتيريا ( Halanaerobium ( genus كانت الأكثر وفرة في جميع العينات وتلتها Deferribacter و Desulfovermiculus وكما هو متوقع في حالة تلوث التربة بالنفط الخام التقيل المحتوي للكبريت، بكتيريا معالجة الكبريتات (sulfate - reducing bacteria) كانت وفيرة. دعمت النتائج استخدام التربة الملوئة بالنفط الخام الثقيل كمصدر للبكتيريا التي يمكنها البقاء في الظروف القاسية واغراض الاستخلاص المعزز الميكروبي للنفطي.
هنالك العديد من البكتيريا التي يمكنها النمو باستخدام النفط الخام الخفيف كمصدر لعنصر الكربون ولكن البكتيريا يمكنها التي النمو باستخدام النفط الخام الثقيل فقط محدودة. استهدف البحث العثور على Spore -forning bacteria وبالتالي تم تسخين عينات التربة للتخلص من جميع أنواع البكتيريا التي لا يمكنها تحمل الحرارة ولا يمكنها تكوين ابواغ (spores) بداخلها. تم اختبار خمسة أنواع من السوائل المغذية للبكتيريا بإضافة النفط الثقيل الخام (API 13°) كمصدر وحيد للكربون وتم العثور على 15 سلالة من بكتيريا Bacillus subtilis و Bacillus licheniformis. تم تحديد سلالة البكتيريا عن طريق MALDI biotyper و 16S rRNA sequencing وجل تسلسل ال 16S rRNA في قاعدة بيانات بنك الجينات ( GenBank NCBI accession numbers: KJ729814 to KJ729828)
اثبتت البكتيريا قدرتها على تحليل النفط الخام الثقيل في الظروف الهوائية واللاهوائية من خلال photospectrometer و well - assays و GC - FID وثبت أن أفضل وسيط للنمو هو السائل المغذي M2. كانت بكتيريا Bacillus subtilis AS2 و Bacillus licheniformis AS5 الأكثر كفاءة في التحلل الأحيائي للنفط في اختبارات ضخ السوائل بعينات الصخور الرملية (Berea Sandstone) المحاكيه للظروف الميدانية بحقول النفط، زادت بكتيريا Bacillus licheniformis AS5 نسبة استخلاص النفط الخام الثقيل 16% بعد أبقائها بالصخور الرملية. أظهرت الدراسة المجهرية المقطعية للصخور نمو البكتيريا بداخلها وأظهر تحليل GC-FJD تحلل النفط المنتج. يتمثل التحدي الرئيسي من التجربة اللاهوائية لضخ السوائل والنفط الخام الثقيل والبكتيريا بعينات الصخور الرملية في الوقت حيث ان تجربة عينة الصخر الواحدة تستغرق ما لا يقل عن ثلاثة أسابيع بما في ذلك فترة حضانة البكتيريا. وبالتالي تم اختبار تجربة ضخ أعمدة الرمال كبديل لضخ عينات الصخور الرملية بهدف توفير الوقت والكلفة. ولكن وعلى الرغم من قابلية كونها الحل الأنسب لمثل هذه التجارب الطويلة الأمد في الصخور، فإن تجربة ضخ أعمدة الرمال لم تنجح بسبب المسامية والنفاذية العاليتين لأعمدة الرمال ولزوجة النفط الثقيل معا.
أظهرت اختبارات فعالية استبدال مصادر النيتروجين المختلفة بالسائل المغذي M2 آن خلاصة الخميرة ( yeast extract) هي مصدر النيتروجين الأمثل للبكتيريا حيث أظهرت أعلى مستوى النمو بالمقارنة مع اليوريا (urea) ونترات الأمونيوم (ammonium nitrate). واسفرت الاختبارات آن اضافة الجلوكوز (glucose) أدت الى زيادة نمو البكتيريا وبالمقابل أدت اضافة ثيوكبريتات الصوديوم (sodium thiosulfate) الى انخفاض النمو.
تمت سلسلة الجينوم كاملا لكل من بكتيريا Bacillus subtilis AS2 و Bacillus licheniformis AS5 ومقارنتها بانواعها من البكتيريا النموذجية 168 .Bacillus subtilis str و Bacillus lichenifornis DSM
13. بالنسبة الى الخصائص المتعلقة بقدرة البكتيريا على تحليل المركبات، تميزت بكتيريا AS2 بإثنان من الجينات لم تظهرهما البكتيريا النموذجية 168 .Bacillus subtilis str: جين تحلل المركبات العطرية ( aromatic
pcaC ( compounds و جین تحلل مركبات الأمينوبنزوات (atoD ( aminobenzoate واحتوت بكتيريا AS5 على جينات تحلل مركبات مماثلة للبكتيريا النموذجية 13 Bacillus licheniformis DSM في ما عدا تلك المتعلقة بتحلل مركب Styrene. تساوت جميع البكتيريا المحلية والنموذجية في احتوائها لجينات تحلل مماثلة الثلاثة عشر نوعا من المركبات الهيدروكربونية الأخرى وتضمنت على مختلف الجينات، ولم تحتوي اي منهما على جينات تحلل المركبات التالية: Fluorobenzoate و Toluene و Nitrotoluene و polycyclic aromatic hydrocarbon. بالنسبة الى الخصائص المتعلقة بقدرة البكتيريا على انتاج biosurfactants، احتوت بكتيريا AS2 على جينات surfactin and iturin biosurfactants في حين احتوت البكتيريا النموذجية Bacillus 168 .subtilis str على جينات surfactin and plipastatin biosurfactants، واحتوت بكتيريا AS5 على جيناتlichenysin biosurfactant مماثلة للبكتيريا النموذجية 13 Bacillus licheniformis DSM.
لم تنتج البكتيريا أي منتجات بكتيرية (bioproducts) باستخدام السوائل المغذية السابقة. وبالتالي تم اختبار اثنان من السوائل المغذية المستخدمة لإنتاج منتجات بكتيرية من بكتيريا مشابهة لبكتيريا هذه الدراسة. انتجت بكتيريا AS2 مركب منشط للسطح (biosurfactant) ولم تنتج بكتيريا AS5 أي منتج. تمكنت بكتيريا AS2 من خفض التوتر السطحي (surface tension) مع الهواء إلى /xmN 28 . 78 + 0 .) الى mN/ m 4 . 22 + 0 . 60 . اشارت اختبارات أعمدة الرمال الأولية إلى إمكانية زيادة نسبة استخلاص النفط الخام الثقيل بنسبة %5 -4 عن طريق ضخ AS2 biosurfactant مما يعد مؤشرا جيدا لإمكانية زيادة نسبة استخلاص النفط بعينات الصخورالرملية المحاكيه للظروف الميدانية. أظهر طيف الأشعة تحت الحمراء FTIR تشابه AS2 biosurfactant مع مركب منشط السطح القياسي Surfactin (biosurfactant ( Sigina chemicals , USA . أما بالنسبة الى الخصائص المتعلقة بقدرة البكتيريا على إنتاج البوليمر، أظهرت كل من البكتيريا المحلية والنموذجية جينات مماثلة لإنتاج وتحلل البوليمر الحيوي ولكن لم توجد بالبكتيريا المحلية AS2 و AS5 جين انتاج البوليمر: pesC.
Category
Theses and Dissertations
File size
30.39 MB
0
0
