Document
Molecular characterization of chili leaf curl virus and satellite DNA associated with peppers in Sultanate of Oman
Publisher
Sultan Qaboos University
Gregorian
2012
Language
English
Subject
English abstract
Abstract Pepper (Capsicum annum) is cultivated in Al-Batinah, Al-Sharqiya and Dhofar regions in the Sultanate of Oman during the winter season to meet the high demand for fresh produce in the domestic market. To identify the causal agent of a widespread disease associated with infestations of the whitefly Bemisia tabaci (Genn.), leaves were collected from hot pepper and sweet pepper plants showing symptoms characteristic of the begomovirus disease in southern and northern regions of Oman during 2010 and 2011. Typical symptoms of chili leaf curl disease were observed on infected pepper plants that includes shortening of stem internodes, interveinal yellowing, upward curling of the leaf blade, downward rolling of the leaf blade, reduction of the leaflet area, fruit discoloration and fruit size reduction. The disease incidence varied from farm to farm ranging 0-100% irrespective of geographic locations but depending on farmer's management practice. In general pepper seedlings protected from whiteflies in nursery and for few weeks post transplanting showed little or no begomoviral symptoms. On the contrary seedlings infested with whiteflies in nursery and field exhibited severe symptoms with disease incidence of 80-100%. Total nucleic acids were isolated from the symptomatic pepper leaves and used as the template for polymerase chain reaction (PCR) to confirm the presence of begomovirus. Seventeen out of 34 symptomatic samples were tested positive with begomoviral specific PCR primers. Subsequently, nucleic acid from PCR positive symptomatic samples was used for 029 DNA polymerase amplification of begomoviral circular DNA. Putative full unit length begomoviral DNA multimers were digested with Xbal and cloned into the plasmid vector pUC19. The complete nucleotide (nt) sequence was determined as 2758 base pairs (bp), indicative of a monopartite begomoviral genome. A comparison of the genome sequences of twelve field isolates indicated that they shared 97 – 100% nt identity. The virus from Oman was found to be most closely related to Chili leaf curl virus-Multan (ChLCV-Multan) sharing >91% nt identity, a monopartite begomoviral isolate described previously from Pakistan. A satellite DNA (DNA B) was amplified by PCR using begomovirus beta satellite specific degenerate primers. Full-length satellite DNAs were cloned and their DNA sequence were determined. Beta satellite were found to have circular ssDNA genome with single ORF (C1) know to function as pathogenicity determinant. Analysis of the complete nt sequence of 1327 bp indicated that the DNA
nce
B shared 95% nucleotide similarity with its closest relatives, Tomato yellow leaf curl betasatellite-Al-Batinah isolated from tomato in Oman. The genome organization of all isolates of Chili leaf curl virus from Oman was similar to those of other monopartite begomoviruses. All ChLCV isolates showed circular, ssDNA genome with six ORFs (V1, V2, C1, C2, C3, C4) of which two were arranged in virion sense and four in complimentary sense. The amino acid sequence analysis revealed that Vi and V2 ORFs have highest similarity with PepLCV-Lahore and ChLCV-Lahore, respectively and C1-C4 ORFs showed highest similarity with ChLCV-Multan indicating the presence of recombination. Using the RDP3 recombination detection program, a recombination event involving Pepper leaf curl virus-Lahore as a minor parent, and Chili leaf curl virus-Multan and Papaya leaf curl virus-India as major parents were detected in ChLCV-OM sequence. Infectious clone consist of the partial tandem repeat of the viral genome were constructed in the binary vector PCAMBIA 1301 and agroinoculated to Nicotiana benthamiana. The viral clone produced severe upward leaf curl of the small, newly emerged leaves and vein thickening compared to controls.
Member of
Resource URL
Arabic abstract
يزرع محصول الفلفل في المناطق الساحلية لمحافظات الباطنة ، و الشرقية، و ظفار في سلطنة عمان خلال فصل الشتاء وذلك لتغطية الطلب العالي في السوق المحلية الفلفل الطازج. وخلال هذه الفترة يصاب محصول الفلفل بمرض تجعد أوراق الفلفل الذي ينتقل عن طريق الذبابة البيضاء (Bemisia tabaci)، ولمعرفة مسبب ذلك المرض المتفشي فقد تم جمع أوراق الفلفل الحار والفلفل الرومي التي تظهر عليها الأعراض المثالية للمرض الذي تسببه الفيروسات والتي تنتمي إلى الجنس Begomovirus من المناطق الشمالية والجنوبية للسلطنة خلال عامي 2011 و 2012. وقد لوحظت الأعراض المثالية الآتية لمرض تجعد أوراق الفلفل المصاب والتي تتمثل في تقزم الأجزاء الواقعة بين العقد في الساق ، واصفرار المناطق الواقعة بين العروق، وتجعد الأوراق للأعلى، والتفاف حوافها للأسفل، وصغر حجم الوريقات، وتغير لون الثمار وصغر حجمها. تراوحت نسبة الإصابة بالمرض الفيروسي من حقل إلى حقل بين صفر إلى 100% باختلاف الموقع الجغرافي و إدارة المزارع لحقله. كانت نسبة الإصابة بشكل عام منخفضة أو معدومة في نباتات الفلفل التي تتم تغطيتها للوقاية من المرض الفيروسي المنتقل عن طريق الذبابة البيضاء خلال مرحلة الحضانة تستمر التغطية لعدة أسابيع بعد نقلها للحقل. في المقابل ارتفعت نسبة الإصابة بالمرض في نباتات الفلفل خلال مرحلة الحضانة حيث ظهرت عليها أعراض الإصابة بشكل أكبر تراوحت بين 80 إلى 100%. تم عزل الحمض النووي الكامل من أوراق الفلفل وتم استخدامه كقالب لتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) للكشف عن وجود فيروس النوع Begomovirus. أسفرت النتائج عن وجود 17 عينة إيجابية لبؤرة الغطاء البروتيني من اصل 34 عينة. بعد الكشف عن العينات الإيجابية والتي تحتوي على الفيروس تم استخدام الحمض النووي الخاص بها في انتاج جينوم كامل باستخدام التكثير الدائري بالانزيم (029) لمضاعفة الحمض الحلقي لفيروسات Begomovirus. تم تقطيع الحجم المفترض الجينوم Begomovirus والمتكرر في سلسلة واحدة تم بإنزيم (Xbal ) ومن ثم تم استنساخه في البلازميد الناقل من نوع ( pUC19)، تم تحديد السلسلة الكلية لجينوم الفيروس والتي تبين أن طولها يساوي 2758 نیوکلیوتاید ( bp 2758) حيث وجد أن الفيروس المسبب أحادي الجينوم. وبمقارنة سلسلة الجينوم الاثني عشر عينة تبين أن مستوى التشابه في النيكليوتيد بينهن يتراوح بين 97 و 100%. كما تبين أن فيروسات تجعد أوراق الفلفل التي تم تشخيصها في عمان تتشابه بأكثر من 91% مع فيروس تجعد أوراق الفلفل المسجل في ملتان (-ChLCV Multan) بباكستان. وباستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل مرة أخرى للكشف عن الحمض النووي المصاحب الفيروس البيتاساتلايت وذلك باستخدام بادئات تفاعل مخصصة ومن ثم تم استنساخها وتحديد طول سلسلة الجينوم. وجد أن 8-DNA حلقي الجينوم ويحتوي على جين واحد (ORF) هو المسئول عن تحديد أعراض المرض ويدعى هذا الجين ب BC1. وبتحليل سلسلة النيوكليوتيد لهذا الجين والتي تساوي 1327 نیوکلیوتاید تبين أنها تتشابه بنسبة 95% مع Betasatellite لفيروس تجعد واصفرار أوراق الطماطم المعزول من منطقة الباطنة بسلطنة عمان. يحتوي الحمض النووي الدائري أحادي الجينوم لفيروس تجعد أوراق الفلفل على 6 جينات (ORFs), اثنتان منها (1وV2) على الخيط الإيجابي أربعة أخرى هي C2 ، C1 ،3وC4 على الخيط المكمل. وقد كانت هذه الجينات مشابهة لجينات ال begomoviruses أحادي الجينوم والذي ينتقل عن طريق الذبابة البيضاء. وعند مقارنة (V1 و V2) ظهر تشابه مع سلاله باكستان ( PepLCV - Lahore و-ChLCV Lahore).وتبين أيضا عند مقارنة C1ر C4 وحدد تشابه مع سلاله باكستان ( ChLCV - Multan )وذلك باستخدام برنامج (RDP3) المتخصص بتحديد إعادة التركيب تبين أن هذا الفيروس يحتوي على أجزاء من فيروس تجعد أوراق الفلفل المسجل بلاهور والذي يعتبر الأب الأصغر أما الجزء الأكبر من هذا الفيروس فينتمي إلى فيروس تجعد أوراق الفلفل الحلو المسجل في ملتان وفيروس تجعد أوراق الفيفاي المسجل في الهند وهذان الفيروسان يشكلان الأب الأكبر. وقد تم تجهيز نسخة قادرة على إحداث العدوى من الجينوم الأصلي في بلازميد ناقل (1301-pCAMBIA) والتي تم استخدامها لعدوي نبات التبغ (Nicotiana benthamiana). وبعد العدوى ظهرت اعراض التجعد الحاد على الأوراق الصغيرة والحديثة الظهور وتثخن العروق. ووجود هذا النوع من الفيروسات يتطلب دراسة جديدة للتوصل إلى أباء هذا الفيروس في عمان.
Category
Theses and Dissertations