Document

Bacterial diversity and hydrocarbon degradation in oil- polluted soils treated with inorganic and organic biostimulating agents

Publisher
Sultan Qaboos University
Gregorian
2015
Language
English
English abstract
Oman is an oil producing and exporting country, hence it is vulnerable to frequent oil spills during oil production and exploration. Oil spills pose a serious threat to both terrestrial and marine environments and can have a serious impact on the economy of Oman. Oil spills can result in the contamination of underground water and can drastically affect fishing industry, public health, water desalination plants, agriculture, tourism and human health. So far, there is no national strategy in Oman of how to deal with oil spills and how to treat them. Around the world, different remediation methods were employed to clean up oil polluted sites including mechanical, physical / chemical and thermal methods. Bioremediation is one of the safest, environmentally friendly and successful method used in cleaning up oil contamination. Biostimulation is one of the bioremediation approaches that rely on stimulating indigenous microorganisms in the contaminated sites through removing the limiting factors such as nutrient, availability of oil compounds to microorganisms, and aeration. In this thesis, biostimulation was assessed using different stimulating agents. The contaminated soils were studied using physicochemical analysis, CO2 method, hydrocarbon extraction and molecular technique before and after the application of the biostimulation treatment. The work performed in this thesis will help in understanding the diversity of soil microorganisms in different oil contamination sites, and in establishing a base for future biostimulation treatments in Oman. Furthermore, the use of organic wastes as biostimulating agents will open the door for waste management. Below is a summary of the different studies performed in this thesis. Enormous studies were carried out in oil-polluted freshwater and marine environments compared to desert soils although they are frequently exposed to oil contamination. The bacterial diversity of oil-polluted desert soils with different pollution levels was investigated in this study. The five soils from one place display a gradient of oil contamination level (S> OBM > CS > US > B3), with the highest level in S soil and lowest in B3 soil. The bacterial communities of the five soils were profoundly different (ANOSIM R = 0.45, p < 0.0001) as revealed by using automated rRNAintergenic spacer (ARISA) analysis. The shared operational taxonomic units between five soils were less than 20%. We found that soils with higher oil contamination level had highest operational taxonomic units (OTU) richness. Multivariate analyses of ARISA profiles revealed that the bacterial communities in the S soil, which contains the highest level of contamination, was different from the other soils and formed a completely separate cluster. From 454 pyrosequencing analysis, a total of 16,657 ribosomal sequences were obtained, with 42-89% of these sequences belonging to the phylum Proteobacteria. In all soils, sequences belonging to Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Bacilli and Actinobacteria were found. While the sequences belonging to anaerobic bacteria from the classes Deltaproteobacteria, Clostridia and Anaerolineae were only detected in the S soil, sequences belonging to the genus Terriglobus of the class Acidobacteria were only detected in the lowest contaminated soil (B3). The variation in bacterial communities between soils was strongly determined by oil contamination level asshowen by redundancy analysis (RDA). Our conclusion is that desert soils are rich in aerobic and anaerobic bacteria that could potentially contribute to the degradation of hydrocarbons as well as oil contamination level exert a strong selective pressure on bacterial communities. We compared the response of oil-polluted desert and marine soils to biostimulation using three nonioinc surfactants, Triton X-100, Tween-80 and Brij-35 and inorganic nutrients, nitrogen and phosphorous (N and P) at different ratios. The addition of Tween-80 and Brij-35 resulted in an increase in the produced CO2 from 2.1+0.01 to 2.5+0.1 and from 0.7+0.01 to >1.3+0.02 mg CO2 g soil in the desert and marine soil, respectively. This corresponded to 51% increase in the oil mineralization rate in the marine soil, but only to 20% increase in the desert soil. The effect of Triton X-100 was less conspicuous on the respiration activities of both soils. The addition of inorganic nutrients had a more pronounced biostimulating effect in the marine than in the desert soil. The produced CO2 in the marine soil was comparable at the different N:P ratios. Physical and chemical characterization of the two soils revealed higher oil content and lesser nitrate concentrations in the desert than in the marine soil. While the desert soil texture was classified as silt loam, the marine soil texture was sandy loam. The bacterial communities were very different, with no common genera between the two soils. While the bacterial classessAlphaproteobacteria, Gammaproteobacteria and Actinobacteria were detected in both soils, Betaproteobacteria was detected only in the desert soil and Deltaproteobacteria and Firmicutes were only found in the marine soil. We conclude that biostimulation depends very much on the physical and chemical conditions and the biological characteristics of polluted sites. Therefore, bioremediation has to be tailored specifically for each site. Waste materials have a strong potential in the bioremediation of oilcontaminated sites, because of their richness in nutrients and their economical feasibility. We used sewage sludge, soybean meal and wheat straw to biostimulate oil degradation in a heavily contaminated desert soil. While oil degradation was assessed by following the produced CO2 and by using gas chromatography-mass spectrometry (GCMS), shifts in bacterial community composition were monitored using illuminaMi$eq. The addition of sewage sludge and wheat straw to the desert soil stimulated the respiration activities more than the addition of soybean meal. GC-MS analysis revealed that the addition of sewage sludge and wheat straw resulted in 1.7 to 1.8 fold increase in the degraded C14 to C30 alkanes, compared to only 1.3 fold increase in the case of soybean meal addition. The degradation of > 90% of the C14 to C30 alkanes were measured in the soils treated with sewage sludge and wheat straw. MiSeq sequencing revealed that the majority (76.5-86.4% of total sequences) of acquired sequences from the original soil belonged to Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria and Firmicutes. Multivariate analysis of operational taxonomic units (OTUS) placed the bacterial communities of the soils after the treatments in separate clusters (ANOSIM R=0.66, P=0.0001). The most remarkable shift in bacterial communities was in the wheat straw treatment, where 95-98% of the total sequences belonging to Bacilli. We conclude that sewage sludge and wheat straw are useful biostimulating agents for the cleanup of oil-contaminated desert soils. Organic waste materials are potential stimulating agents for bioremediation of oil-polluted soils as they are cheap and environmentally safe. Spent mushroom compost (SMC) and poultry manure (PM) are by-product organic waste materials produced from big factories in Oman. We investigated the effect of spent mushroom compost (SMC), poultry manure (PM) and urea in the stimulation of respiration activities and oil degradation in a polluted desert soil. Besides that, we studied the shifts in bacterial community structure after treating soils with organic waste materials by using MiSeq sequencing. The addition of SMC and PM resulted in a significant increase of the evolved CO2 from 8.7+1.9 to 25.7+1.6 and to 23.4–1.2 mg CO2g' soil after 96 days of incubation, respectively. However, urea addition did not significantly change respiration activities. The addition of organic wastes increased the rate of alkanes degradation (C14C30) by twofold compared to untreated soil as revealed by GC-MS analysis. Clear shifts in the bacterial community of the original soil was detected, particularly in the relative abundance of Firmicutes, Actinobacteria and Proteobacteria, which constituted 87-94% of total sequences. The relative abundance of Firmicutes remained unchanged after the addition of PM (37-48% of total sequences), but it dramatically decreased in the SMC treatment (0.5-4.5%) and increased in the urea treatment (44-87%). The addition of SMC increased the relative abundance of Alpha-, Gamma-proteobacteria and Actinobacteria. We conclude that, SMC and PM waste material are effective alternative sources of nutrient in treating oil pollution in desert areas.
Arabic abstract
إن سلطنة عمان دولة منتجة ومصدره للنفط، وبالتالي فهي معرضة كغيرها لحوادث النفط المتكررة كالتسربات أثناء الإنتاج والتنقيب عن النفط. فالتسربات النفطية تشكل تهديدا خطيرة للبيئتين البرية والبحرية، ويمكن أن يكون لها تأثيرة خطيرة على الاقتصاد العماني، ويمكن أن تؤدي إلى تلوث المياه الجوفية. وأيضا لها تأثير بشكل كبير على صيد الأسماك، والصحة العامة، ومحطات تحلية المياه، والمياه الجوفية، والزراعة والسياحة وصحة الإنسان. حتى الآن؛ لا توجد استراتيجية وطنية معلنة في سلطنة عمان عن كيفية التعامل مع حوادث تسربات النفط.و في جميع أنحاء العالم تستخدم طرق مختلفة لمعالجة الأماكن الملوثة بالنفط، بما في ذلك الطرق الحرارية والميكانيكية والكيميائية / الفيزيائية. أما المعالجة البيولوجية فهي واحدة من أسلم وأنجح الطرق لمعالجة التلوث، وهي ايضا صديقة للبيئة. ويعد التحفيز الحيوي أحد أهم طرق المعالجة البيولوجية التي تعتمد على تحفيز الميكروبات الأصلية في الأماكن الملوثة بالنفط وذلك من خلال إزالة العوامل التي تحد من نشاطها كالمواد الغذائية، وتوافر المركبات النفطية للكائنات الحية الدقيقة، وتوفر الأكسجين.
وفي هذه الأطروحة، تم تقييم التحفيز الحيوي باستخدام مواد محفزة مختلفة. حيث تمت دراسة التربة الملوثة بالنفط باستخدام التحاليل الفيزيائية والكيميائية وطريقة ثاني أكسيد الكربون و تحليل النفط والتقنية الجزيئية قبل وبعد تطبيق التحفيز الحيوي. وبالتالي فإن العمل المقام في هذه الأطروحة سيساعد في فهم تنوع الكائنات المجهرية المتواجدة في التربة الملوثة من عدة مناطق مختلفة، وإنشاء أساس لطريقة التحفيز الحيوي المستقبلية في سلطنة عمان، وعلاوة على ذلك، فإن استخدام المخلفات العضوية كمحفزات حيوية، يفتح المجال لإعادة تدوير وإدارة النفايات. وفيما يلي ملخص للدراسات المختلفة التي أجريت في هذه الأطروحة
بالرغم من أن التربة الصحراوية تتعرض بشكل كبير للتلوث بالنفط، فإن العديد من الدراسات المتعلقة بالنفط تركزت في البيئات البحرية والمياه العذبة الملوثة.
تمت دراسة التنوع الميكروبي للتربية الصحراوية الملوثة بالنفط في خمس مستويات مختلفة للتلوث. هذه الأنواع الخمسة من الأتربة هي من موقع واحد وقد بينت تلوثأ تدريجية للنفط (S ) OBM>CS>US>B3)، وفقا الأعلى مستوى في التربة S وأدناها في التربة B3. المجتمعات البكتيرية لهذي الأتربة الخمسة مختلفة اختلافا عميقا ( 0 . 45 = ANOSIM R، 0 . 0001> 2) باستخدام تحلیل(ARISA). وشكلت الوحدات المشتركة OTU بين الأتربة الخمسة أقل من ۲۰٪. حيث أن التربة التي تحتوي علي أعلي نسبه تلوث لديها أعلى نسبه ثراء في OTU.
كشف تحليل ARISA أن المجتمعات الميكروبية في التربية s، والتي تحتوي على أعلى مستوى من التلوث، كانت مختلفة عن الأتربة الأخرى، وشكلت كتلة منفصلة تماما. ومن تحليل pyrosequencing-454، تم الحصول على مجموع ۱۹۹۰۷ تسلسل الريباسي، منها ۹۲-۸۹٪ من هذه التسلسلات تنتمي إلى الأسرة Proteobacteria. وجدت التسلسلات التي تنتمي إلى GammaproteobacteriaBetaproteobacteria Bacilli و Actinobacteria في جميع أنواع الأتربة الخمسة. في حين في حين أن التسلسلات التي تنتمي إلى البكتيريا اللاهوائية من فئةClostridia ، Deltaproteobacteria وAnaerolineae وجدت فقط في التربة S. أما التسلسل الذي ينتمي إلى جنس Terriglobus من فئة Acidobacteria فقد تم اكتشافه فقط في التربة الملوثة بأدني مستوي من النفط (3). لذلك فإن التباين في المجتمعات الميكروبية بين الأتربة مرتبط بشدة بمستوى التلوث النفطي كما وضح من خلال تحليل ال (RDA). حيث استنتجنا بان التربة الصحراوية غنية بالبكتيريا الهوائية واللاهوائية والتي قد تساهم في تحليل المركبات الهيدروكربونية ، وكذلك بأن مستوى التلوث النفطي يمارس ضغطأ انتقائية قويا على المجتمعات البكتيرية.
في الدراسة الثانية، تمت مقارنة استجابة تربة ملوثة بالنفط من الصحراء القاحلة ومن ساحل البحر للتحفيز الحيوي من خلال استخدام ثلاثة مذوبات غير أيونية (تريتون 100-X، توین. ۸۰ وبريج-۳۵)، ومواد مغذية غير العضوية (نتروجين و فوسفور) بنسب مختلفةأدت إضافة المذوبات توین. ۸۰ وبريج-35 في زيادة ثاني أكسيد الكربون والذي أرتفع مستواه من ۲٫۱ + ۰٫۰۱ إلى ۲ ، 5 + ۰٫۰۱ ومن ۰٫۷+ ۰٫۰۱ إلى >۱٫۳ + ۰٫۰۲ ملغ ثاني أكسيد الكربون في جرام واحد من التربة في التربة الصحراوية والتربة الساحلية البحرية على التوالي. إضافة المذوب تريتون 100-X لم يظهر أي تأثير كبير في كلتا التربتين. وقد أظهرت المواد الغذائية غير العضوية لها تأثير علي التحفيز الحيوي أكثر وضوحافي التربة الساحلية البحرية من التربة الصحراوية. وإن إنتاج ثاني أكسيد الكربون في التربة الساحلية البحرية للنسب المضافة ل N : P كان متقاربا إذ وصل الحد الأقصى فيه إلى ۱٫۲۰٫۰۷ ملغ ثاني أكسيد كربون في جرام واحد من التربةتبين أن المجتمعات البكتيرية في كلتا التربتين مختلفة جدا عن بعضها، مع عدم وجود جنس مشترك بينهما. في حين أن الفئات البكتيرية Alphaproteobacteria و Gammaproteobacteria و Actinobacteria تواجدت في كلتا التربتين، قد تم العثور على Betaproteobacteria فقط في التربة الصحراوية و Deltaproteobacteria و Firmicutes في التربة الساحلية البحرية. استنتجنا بأن التحفيز الحيوي مرتبط بالموقع، ونجاح التحفيز يعتمد إلى حد كبير على الخصائص الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية للموقع.
في الدراسة الثالثة، تم استخدام رواسب الصرف الصحي و فول الصويا وقش القمح في تحفيز تحليل النفط في التربة الصحراوية الملوثة. وذلك أن النفايات العضوية لديها إمكانية قوية في المعالجة البيولوجية للاماكن الملوثة بالنفط لغناها بالمواد الغذائية وجدواها الاقتصادية. تم إجراء تقييم تحلل النفط بطريقتين: تطور ثاني أكسيد الكربون وتحليل المواد الهيدروكربونية من قبل جهاز ( GC - MS ). وتم رصد التغيرات في تركيبة المجتمع البكتيري باستخدام illuminaMiSeq. أن أضافه رواسب المجاري و قش القمح في التربة الملوثة قد حفزا نشاط التنفس أكثر من أضافه فول الصويا. أظهر تحلیل GC - MS أن أضافة رواسب الصرف الصحي و قش القمح أدت الي زيادة بمقدار ۱٫۷ الي ۱٫۸ ضعف في تحلل الالكانات (Cid to C30) ، مقارنة بفول الصويا الذي نتج عنه ۱٫۳ زيادة فقط أكثر من ۹۰% من الأكانات (Cg4 to C30) قد تحللت في التربة المعالجة بالصرف الصحي والقش. وكشف تحليل MiSeq عن غالبية التسلسلات ( ۷۹ , ۰ - ۸۹٫۶% من المجموع الكلي للتسلسلات) في التربة الغير المعالجة تنتمي الي فئةFirmicutes y Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteriaتحلیل متعدد المتغيرات للوحدات التصنيفية التشغيلية (OTUs) وضع المجتمعات البكتيرية فالتربة المعالجة في مجموعات منفصلة , ( 0. 0001=ANOSIM R= 0 . 66 , P). وكان التحول الأبرز في المجتمعات البكتيرية في التربة المعالجة بقش القمح، حيث ۹۵-۹۸٪ من إجمالي تسلسل تابعة Bacilli. نخلص إلى أن رواسب الصرف الصحي وقش القمح كعوامل تحفيزية مفيدة لتنظيف التربة الملوثة بالنفط الصحراء.
في الدراسة الرابعة، تم التحقق من مدى تأثير سماد الفطر المستهلك وسماد الدواجن واليوريا في تحفيز نشاط التنفس و تحلل النفط في التربة الصحراوية الملوثة. إن سماد الفطر المستهلك وسماد الدواجن هي من أهم النفايات العضوية التي تنتج من مصانع كبيرة في سلطنة عمان، كما أنها رخيصة وآمنة بيئيا. وايضا، قمنا بدراسة التغيرات في بنية المجتمع البكتيري بعد معالجة التربة بهذه المواد وذلك باستخدام MiSeq. أدت إضافة سماد الفطر المستهلك وسماد الدواجن في زيادة كبيرة في ثاني أكسيد الكربون من ۸۷ د ۱، ۹ إلى ۷، ۲۵ + ۱٫۹ و ۲۳٫۶ + ۱٫۲ ملغ ثاني أكسيد الكربون في جرام واحد من التربة بعد 16 يوما من الحضانة على التوالي. ولكن إضافة اليوريا لم تغير نشاط التنفس الميكروبي في التربة بشكل ملحوظ. إضافة النفايات العضوية زادت نسبة تحلل الألكانات ( Ca - C30 ) بمقدار الضعف مما كانت عليه في التربة غير المعالجة كما أتضح من تحليل GC- MS . تم الكشف عن تحولات واضحة في المجتمع البكتيري للتربية الأصلية، ولا سيما في الوفرة النسبية للفئات Firmicutes وActinobacteria و Proteobacteria و التي تشكل ۸۷-۹۹٪ من مجموع التسلسلات. بعد أضافه سماد الدواجن ضلت الوفرة النسبية لل Firmicutes دون تغيير ( 48-37)% من مجموع التسلسلات، ولكنه انخفضت بشكل كبير عند أضافه سماد الفطر المستهلك (%4. 5-0 . 5) وزادت عند أضافه اليوريا ( ۸۷. 44 ٪). إضافة سماد الفطر المستهلك رفع من الوفرة النسبية للفنات ,-ActinobacteriasGamma - proteobacteria Alpha. نخلص إلى أن سماد الفطر المستهلك و سماد الدواجن مصادر بديلة فعالة كمواد غذائية في علاج التلوث النفطي في المناطق الصحراوية.
Category
Theses and Dissertations

Author's Work

Theses and Dissertations
0
0
Al-Kindiyah, Sumaiya Abdullah Ahmed.
Sultan Qaboos University
2010

Same Subject

Theses and Dissertations
0
0
Al-Haddabiyah, Laila Hamed Sultan.
Sultan Qaboos University
2003
Theses and Dissertations
1
0
Al-Sabahy, Jamal Nasser.
Sultan Qaboos University
2008
Theses and Dissertations
0
0
Al-Yaqoubi, Abdullah Hamood Awadh.
Sultan Qaboos University
2008